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纳米颗粒跟踪分析技术为外泌体表征开拓新途径

来源:点击:2446发布时间:2015-09-19

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中,是细胞主动分泌,大小较为均一,直径为30~100纳米,密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。随着分子技术的不断发展,生物学界对外泌体的探索日趋深入。2013年,三位国外科学家因在细胞膜转运机制的研究上取得关键性突破,被授予诺贝尔生理学或医学奖。由此,外泌体的研究达到了一个全新的高度。

而近年来,越来越多的证据显示出外泌体对临床治疗的重要价值。外泌体是细胞间信使,通过其数量和生物化学组成的变化,可为进一步的临床诊断提供有力的证据。它携带多种蛋白质和miRNA,参与细胞信号转导、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程,并且有可能成为药物的天然载体,应用于肿瘤检测或临床治疗。

但目前国内在外泌体研究方面的经验十分有限,无论是离心法、过滤离心还是免疫磁珠法,都无法同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。这首先就制约了外泌体样本的制取,进而对后续的表征造成困难。而测量技术的局限性也极大地阻碍了外泌体在这些领域的研究进展。

为了与国际先进水平接轨,同时推动中国医疗事业的发展,使更多中国患者获得康复良机,广州某三级甲等医院抓住国内外泌体研究的先机,于今年启动了针对骨髓瘤的外泌体表征工作。但是首先,他们在研究设备的选择上犯了难。

在当前中国市场主流的外泌体表征方法中,研究人员的选择一般有电子显微镜、流式细胞仪和动态光散射技术。但电子显微镜一次只能观测数量有限的颗粒,在代表性上存在严重不足,同时,由于电子显微镜的样本制备过程比较复杂,因此很容易造成样本的形态、状态发生改变;流式细胞仪目前公认的测量颗粒粒径下限为300nm左右,大大超过了外泌体的粒径上限;而动态光散射技术不适合多分散的复杂外泌体样本的测量,且无法得出样品中外泌体的浓度。

后来,经过对国际上最顶尖的研究设备进行慎重分析和比对,该医院开始留意英国马尔文仪器有限公司(以下简称“马尔文”)的产品。作为全球材料和生物物理表征领域的领先企业,马尔文为全球众多客户提供高性能的粒度表征解决方案,在业界享有盛誉。特别是其采用了全新一代纳米颗粒跟踪分析技术(马尔文专利技术,以下简称NTA)的NanoSight产品系列,可以直接并实时观测纳米颗粒,通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号,拍摄其在溶液中做布朗运动的影像,再对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。这一新颖的纳米颗粒表征方法立即吸引了该家医院。果然,马尔文没有让他们失望。

完善功能全方位响应客户需求

从接洽到接受NTA技术,仅在短短的3个月内该医院就决定采用马尔文NanoSight系列最新型号的产品——NS 300纳米颗粒跟踪分析仪(以下简称“NS 300”)。对此次合作,马尔文NanoSight产品专家梅洁先生表示:“说服客户的不是我们的专家,而是马尔文的产品本身。”

在为该医院提供详细的设备培训后,马尔文NS 300便马上投入到了研究使用中。很快,它凭借卓越高效的性能和方便快捷的操作获得了客户研究团队的普遍认可。

出色的质控作用

外泌体的提取一直以来都是横亘在所有相关研究者面前的一道难题。生物细胞中的囊泡种类繁多,怎样证明提取的颗粒一定就是外泌体呢?电子显微镜在鉴定一定数量的颗粒属性方面固然有效,但如前所述,电子显微镜不适合对大量颗粒进行快速分析,而动态光散射技术又只能对分布相对均一的样本颗粒进行检测,并且不具备荧光功能。

配备了先进NTA检测技术的马尔文NS 300在这时便体现出强大的功能:它能够进行严格的质控,通过对观察到的所有颗粒进行分析和计算,第一时间给出样本粒度的详细分布和浓度的具体信息。同时,研究人员还可以利用荧光标定重点的特定外泌体颗粒,从四种不同波长——405nm、 488nm、 532nm和635nm——的激光器中选择一款,搭配相应的滤光片,从而实现对荧光样品的测量,再由NTA技术对其进行单独检测,免受复杂样本(如血清、尿液等)环境的影响。对复杂样品的分辨能力对于像外泌体这样的研究对象来说至关重要。

尤为关键的是,由于NTA的工作原理是通过将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品(悬浮颗粒的溶液)进行照射,配以玻璃表面镀铬使背景信号最小化,可让研究人员通过显微镜直接观察到纳米颗粒在溶液中的布朗运动,并拍摄影像,对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,快速准确地计算出样本中纳米颗粒的流体力学半径和浓度。相对于其他传统技术,NTA能对悬浮液中粒径范围为10nm-2000nm的颗粒进行全方位表征,并且兼具极高的分辨率,对于粒度较为接近的颗粒仍然可以准确分析,特别适用于外泌体、蛋白质聚集、药物传输、纳米颗粒毒理、病毒和疫苗等复杂体系的相关研究。

另外,马尔文NanoSight还可以测定颗粒的数量,准确指示样本溶液中的单位体积颗粒浓度和颗粒数量,进行以量为基准的粒径测试和分布测试。对于客户可能存在的样本量不足的研究情况,马尔文NS 300也能通过支持低浓度测试(最低可达到300微升)帮助实现既定监测目标;而同样的条件,传统电子显微镜很难实现有效的统计学分析。

操作简便、工作效率高

通常,大型仪器(如流式细胞仪)在使用前都需要进行复杂的预热和校准准备。马尔文NS 300则无需这样做,它只要连上电源就能直接使用。并且由于NTA技术采用的是斯托克斯-爱因斯坦方程的计算,所提供的是一个无关质量、折光度和颗粒材料的流体力学直径,因此仪器可跳过繁琐的校准直接进入研究分析,为工作人员节省研究前的时间。

作为一种集成程度和自动化程度都非常高的仪器,马尔文NS 300除了将软硬件设备、摄像头和显微镜等集于一体,还整合了颗粒检测功能与纳米颗粒分析技术,为纳米颗粒表征提供易于使用的可重复平台。40cm x 25cm的设备主机集成了超高灵敏度科研级sCMOS光电传感器、温控单元和一个具有四种可选波长的激光。样品池和激光模块也能轻易的拆卸和组装,便于移动、清洁,适合高通量检测。强大的软件分析能力让马尔文NS 300在极短的时间内就能绘制出粒径—对应数量分布强度—颗粒散射光强的三维图谱,并得出与各种粒径颗粒有关的全面信息。这样不仅减少了人为操作失误的概率,更大大提高了研究人员的工作效率。

据该客户介绍,在使用马尔文仪器NS 300之前,原本使用流式细胞仪做4个实验项目,可能要花一个下午的时间,而现在用马尔文NS 300,一个小时就能轻松搞定,且分析结果全面、可靠。对他们来说,这不光节约了大量的时间,加速推进整个科研进程,还为医院节省了宝贵的人力成本。

“市面上常见的表征仪器往往只具有单一的功能,无法满足我们全方位的要求,之所以最后选择马尔文NS 300也正是考虑到它在功能上的完善。可以说,到目前为止,NS 300给我们提供了很大的帮助。”该医院血液科某唐姓医生表示。

增值服务保障产品最佳状态

作为颗粒物表征技术的市场领导者,马尔文不断把行业中的顶尖技术带到中国,让客户买到的不只是一个硬件,而是一整套解决方案。除了技术创新,马尔文也一贯注重客户服务,其技术团队人数是销售团队的3倍,涵盖了学术级专家、应用专家和服务工程师等,他们会参与客户的研究工作,深入了解客户需求,为其提升产品价值。

在此次合作中,除了高品质的产品,马尔文所提供的专业的应用支持,也是该医院选择马尔文的关键原因。在设备采购的沟通阶段,马尔文就为客户提供了细致的产品咨询,帮助他们根据具体的研究需要采购设备。而在开始使用阶段,马尔文也安排了专业的指导培训,并针对客户的实验应用环境给出许多专业建议,帮助客户迅速熟悉设备,满足特定实验目标的需求,更快、更好、更有针对性地获得技术表征结果。

在售后阶段,马尔文的工程师们也为该医院提供了全面的维修和维护服务,快速响应他们的要求,帮助他们诊断并解决设备在使用过程中遇到的问题,确保仪器始终处在最佳的工作状态,提升客户满意度。

总结与展望

在马尔文NS 300的帮助下,该医院的外泌体研究表征上目前已取得了初步进展,以有力的证据验证了正常组织细胞和肿瘤组织细胞在外泌体粒径及粒径分布浓度上的差异。目前,更多实验还在进行过程中,相信有马尔文NS 300的鼎力支持,不久的将来会有更多科研进展呈现。

虽然外泌体作为生物标志物的研究在国内尚处于起步阶段,但它在临床治疗领域已显现出巨大的发展潜力。在临床诊断中,简单快速地在复杂生物背景下测量外泌体浓度、粒径是必备要求,目前存在的方法都无法完美地解决这一问题。NTA作为一项全新的测量技术,具有实时观测和荧光测量功能,能够以较高的分辨率,准确地测量颗粒浓度,从而为外泌体大小和浓度研究提供新的思路。而随着越来越多科研机构与研究项目成果的进一步披露,以马尔文NanoSight为代表的新一代NTA技术将会为推进外泌体研究乃至人类健康事业的发展做出更大贡献。

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